★ 利用熒光素酶報(bào)告基因法研究轉(zhuǎn)錄因子USF1結(jié)合調(diào)控馬鹿miR-4811基因啟動(dòng)子機(jī)制

高  仰，韓  青，吳玄燁，索婧媛，金慶梅，劉學(xué)東 ，鄭  冬*

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040）

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為了探究轉(zhuǎn)錄因子上游刺激因子1（USF1）調(diào)控馬鹿（Cervus elaphus）microRNA PC-5P-4811（miR-4811）基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)理，綜合運(yùn)用核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析、基因克隆、點(diǎn)突變、雙熒光素酶報(bào)告基因法等技術(shù)研究USF1結(jié)合miR-4811啟動(dòng)子分子機(jī)制和功能。結(jié)果顯示：（1）截切突變證實(shí)馬鹿miR-4811基因的核心啟動(dòng)子位于上游-3 174 ~ -2 966 bp；（2）轉(zhuǎn)錄因子USF1在-3 378 ~ 73 bp區(qū)域共有2個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)（-3 046 ~ -3 031 bp、-3 045 ~ -3 018 bp），均位于miR-4811核心啟動(dòng)子內(nèi)；（3）USF1作為激活因子可直接結(jié)合上述位點(diǎn)激活miR-4811核心啟動(dòng)子上調(diào)雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究結(jié)果揭示了USF1參與調(diào)節(jié)microRNA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的機(jī)理，并為后續(xù)USF1/miR-4811調(diào)節(jié)軸參與調(diào)控鹿茸再生發(fā)育機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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在哺乳動(dòng)物中，鹿科（Cervidae）動(dòng)物鹿茸是已知唯一具有周期性再生能力的顱骨附件器官，關(guān)于其發(fā)生與發(fā)育機(jī)理的研究在骨發(fā)生和器官級(jí)再生領(lǐng)域備受關(guān)注。miRNA是一種內(nèi)源性、進(jìn)化保守的非編碼RNA，長(zhǎng)度為約為22個(gè)核苷酸， 其作用機(jī)制通常是通過與靶基因mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，降解或緘默mRNA翻譯，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，已有研究表明miRNAs在維持鹿茸再生過程中快速生長(zhǎng)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。項(xiàng)目組在快速生長(zhǎng)期馬鹿鹿茸組織中發(fā)現(xiàn)了一種新miRNA：microRNA PC-5p-4811（以下簡(jiǎn)稱miR-4811）。

項(xiàng)目組在對(duì)馬鹿miR-4811基因上游順式作用元件進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)上游刺激因子1（upstream stimulatory factor 1，USF1）潛在結(jié)合位點(diǎn)。USF1是一種具有保守度較高堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（b-HLH-LZ）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，USF1能夠以二聚體的形式與多種基因啟動(dòng)子區(qū)E-box結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，USF1在真核生物中廣泛表達(dá)，調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖相關(guān)的多種基因表達(dá)。由此提出如下問題：miR-4811基因核心啟動(dòng)子位于什么區(qū)域？USF1結(jié)合位點(diǎn)與miR-4811基因核心啟動(dòng)子在空間分布上具有何種關(guān)系？USF1能否直接結(jié)合并激活miR-4811基因核心啟動(dòng)子功能？本研究通過生物信息學(xué)分析與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)相結(jié)合，定位miR-4811的核心啟動(dòng)子，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子USF1是否通過miR-4811上游調(diào)控區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)參與microRNA PC-5P-4811基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，旨在構(gòu)建基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)探索miR-4811介導(dǎo)鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育的功能機(jī)制研究提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

利用軟件BDGP、PROMOTER2.0、TSSW、PROMPREDICT、FPROM、iProEP預(yù)測(cè)核心啟動(dòng)子，并利用match、P-match、PROMO、AnimalTFDB 3.0及JASPAR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用PCR擴(kuò)增獲得miR-4811的上游調(diào)控序列P1（3 451 bp：-3 378 ~ 73 bp），以P1為模板，分別擴(kuò)增6個(gè)啟動(dòng)子缺失片段：P2（2 231 bp：-3 378 ~ -1 148 bp），P3（1 500 bp：-2 516 ~ -1 017 bp），P4（1 182 bp：-3 378 ~ -2 197 bp），P5（413 bp：-3 378 ~ -2 966 bp），P6（204 bp：-3 378 ~ -3 175 bp），P7（209 bp：-3 174 ~ -2 966 bp）并構(gòu)建對(duì)應(yīng)的pGL4.70報(bào)告基因重組載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組pGL4.70空質(zhì)?；钚约s為0，啟動(dòng)子P1報(bào)告基因載體熒光素酶活性顯著高于pGL4.70空載。啟動(dòng)子載體P5活性顯著高于P4，說明在截去的缺失片段-2 965 ~ -2 197 bp中存在著負(fù)調(diào)控區(qū)域，抑制著啟動(dòng)子活性的表達(dá)。P6載體的啟動(dòng)子活性趨近于0，與空載體一致，即啟動(dòng)子片段P5（-3 378 ~ -2 966 bp）截短到P6（-3 378 ~ -3 175 bp）時(shí)，啟動(dòng)子活性消失，提示缺失的-3 174 ~ -2 966 bp區(qū)域存在核心啟動(dòng)子。構(gòu)建啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體P7（209 bp；-3 174 ~ -2 966 bp），經(jīng)檢測(cè)其雙熒光素酶活性在所有的啟動(dòng)子重組載體中最強(qiáng)，進(jìn)一步確定核心啟動(dòng)子位于該區(qū)域。啟動(dòng)子P7載體活性顯著高于P5，截去的啟動(dòng)子片段P6（3 378 bp ~ -3 175 bp）中存在負(fù)調(diào)控區(qū)域，抑制啟動(dòng)子活性。

● 啟動(dòng)子缺失片段重組質(zhì)粒的KpnI酶切電泳圖

● 馬鹿miR-4811啟動(dòng)子缺失片段重組質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性

為驗(yàn)證USF1對(duì)microRNA PC-5P-4811啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控作用，將USF1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體與pGL4.70-P7啟動(dòng)子載體、pMIR reporter內(nèi)參質(zhì)粒等比共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染等量的pcDNA3.1空載體作為轉(zhuǎn)錄因子的對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示USF1顯著上調(diào)pGL4.70-P7活性（P < 0.000 1）。提示USF1對(duì)于miR-4811轉(zhuǎn)錄具有激活因子功能。

● USF1表達(dá)載體與核心啟動(dòng)子重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)雙熒光素酶活性

進(jìn)一步將USF1和其結(jié)合位點(diǎn)突變型重組載體P7-U1，P7-U2共轉(zhuǎn)染，對(duì)照野生型重組載體pGL4.70-P7，突變型載體雙熒光素酶活性均顯著下調(diào)（P < 0.000 1），佐證了上述2個(gè)位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子USF1直接結(jié)合位點(diǎn)。

● USF1調(diào)節(jié)野生型和突變型miR-4811基因啟動(dòng)子效果比較分析

對(duì)于miRNA，目前研究更側(cè)重于miRNA下游靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、機(jī)制和功能研究，對(duì)miRNA基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究還很少，miRNA基因的正確轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到一個(gè)復(fù)雜調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中調(diào)節(jié)啟動(dòng)子區(qū)域的互動(dòng)是整個(gè)調(diào)控體系中至關(guān)重要的一環(huán)。本研究運(yùn)用核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析、基因克隆、點(diǎn)突變、雙熒光素酶報(bào)告基因法等技術(shù)，證實(shí)馬鹿miR-4811基因的核心啟動(dòng)子位于上游-3 174 ~ -2 966 bp；轉(zhuǎn)錄因子USF1在-3 378  ~ 73 bp區(qū)域共有2個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，與miR-4811核心啟動(dòng)子重疊；USF1作為激活因子可直接結(jié)合上述位點(diǎn)激活miR-4811核心啟動(dòng)子上調(diào)雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。上述結(jié)論為進(jìn)一步揭示馬鹿miR-4811轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和后續(xù)深入探究miR-4811調(diào)控鹿茸再生發(fā)育提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

● 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31671283）

● 第一作者簡(jiǎn)介：高仰（2000—），男，碩士研究生；主要從事野生動(dòng)物遺傳學(xué)研究。E-mail：614190397@qq.com

● *通信作者：鄭冬，E-mail：zhengdong89@163.com