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★ 利用熒光素酶報告基因法研究轉錄因子USF1結合調控馬鹿miR-4811基因啟動子機制

高  仰，韓  青，吳玄燁，索婧媛，金慶梅，劉學東 ，鄭  冬*

（東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040）

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為了探究轉錄因子上游刺激因子1（USF1）調控馬鹿（Cervus elaphus）microRNA PC-5P-4811（miR-4811）基因轉錄的機理，綜合運用核心啟動子和轉錄因子結合位點生物信息學預測分析、基因克隆、點突變、雙熒光素酶報告基因法等技術研究USF1結合miR-4811啟動子分子機制和功能。結果顯示：（1）截切突變證實馬鹿miR-4811基因的核心啟動子位于上游-3 174 ~ -2 966 bp；（2）轉錄因子USF1在-3 378 ~ 73 bp區(qū)域共有2個DNA結合位點（-3 046 ~ -3 031 bp、-3 045 ~ -3 018 bp），均位于miR-4811核心啟動子內；（3）USF1作為激活因子可直接結合上述位點激活miR-4811核心啟動子上調雙熒光素酶報告基因轉錄表達。研究結果揭示了USF1參與調節(jié)microRNA基因轉錄表達的機理，并為后續(xù)USF1/miR-4811調節(jié)軸參與調控鹿茸再生發(fā)育機制提供了重要基礎數據。

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在哺乳動物中，鹿科（Cervidae）動物鹿茸是已知唯一具有周期性再生能力的顱骨附件器官，關于其發(fā)生與發(fā)育機理的研究在骨發(fā)生和器官級再生領域備受關注。miRNA是一種內源性、進化保守的非編碼RNA，長度為約為22個核苷酸， 其作用機制通常是通過與靶基因mRNA的非翻譯區(qū)結合，降解或緘默mRNA翻譯，負調控轉錄后基因表達，已有研究表明miRNAs在維持鹿茸再生過程中快速生長方面發(fā)揮著至關重要的作用。項目組在快速生長期馬鹿鹿茸組織中發(fā)現了一種新miRNA：microRNA PC-5p-4811（以下簡稱miR-4811）。

項目組在對馬鹿miR-4811基因上游順式作用元件進行分析時，發(fā)現多個上游刺激因子1（upstream stimulatory factor 1，USF1）潛在結合位點。USF1是一種具有保守度較高堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（b-HLH-LZ）結構的轉錄因子，USF1能夠以二聚體的形式與多種基因啟動子區(qū)E-box結合，從而實現對靶基因表達的調控作用。作為一種多功能轉錄因子，USF1在真核生物中廣泛表達，調控與細胞生長、細胞增殖相關的多種基因表達。由此提出如下問題：miR-4811基因核心啟動子位于什么區(qū)域？USF1結合位點與miR-4811基因核心啟動子在空間分布上具有何種關系？USF1能否直接結合并激活miR-4811基因核心啟動子功能？本研究通過生物信息學分析與雙熒光素酶報告基因實驗相結合，定位miR-4811的核心啟動子，驗證轉錄因子USF1是否通過miR-4811上游調控區(qū)域的結合位點參與microRNA PC-5P-4811基因轉錄調控，旨在構建基因上游轉錄調控機制，為后續(xù)探索miR-4811介導鹿茸生長發(fā)育的功能機制研究提供重要基礎數據。

利用軟件BDGP、PROMOTER2.0、TSSW、PROMPREDICT、FPROM、iProEP預測核心啟動子，并利用match、P-match、PROMO、AnimalTFDB 3.0及JASPAR進行轉錄因子及結合位點預測。利用PCR擴增獲得miR-4811的上游調控序列P1（3 451 bp：-3 378 ~ 73 bp），以P1為模板，分別擴增6個啟動子缺失片段：P2（2 231 bp：-3 378 ~ -1 148 bp），P3（1 500 bp：-2 516 ~ -1 017 bp），P4（1 182 bp：-3 378 ~ -2 197 bp），P5（413 bp：-3 378 ~ -2 966 bp），P6（204 bp：-3 378 ~ -3 175 bp），P7（209 bp：-3 174 ~ -2 966 bp）并構建對應的pGL4.70報告基因重組載體，轉染進293T細胞中進行熒光素酶活性檢測。實驗結果顯示對照組pGL4.70空質粒活性約為0，啟動子P1報告基因載體熒光素酶活性顯著高于pGL4.70空載。啟動子載體P5活性顯著高于P4，說明在截去的缺失片段-2 965 ~ -2 197 bp中存在著負調控區(qū)域，抑制著啟動子活性的表達。P6載體的啟動子活性趨近于0，與空載體一致，即啟動子片段P5（-3 378 ~ -2 966 bp）截短到P6（-3 378 ~ -3 175 bp）時，啟動子活性消失，提示缺失的-3 174 ~ -2 966 bp區(qū)域存在核心啟動子。構建啟動子雙熒光素酶報告基因載體P7（209 bp；-3 174 ~ -2 966 bp），經檢測其雙熒光素酶活性在所有的啟動子重組載體中最強，進一步確定核心啟動子位于該區(qū)域。啟動子P7載體活性顯著高于P5，截去的啟動子片段P6（3 378 bp ~ -3 175 bp）中存在負調控區(qū)域，抑制啟動子活性。

● 啟動子缺失片段重組質粒的KpnI酶切電泳圖

● 馬鹿miR-4811啟動子缺失片段重組質粒的相對熒光素酶活性

為驗證USF1對microRNA PC-5P-4811啟動子區(qū)域的調控作用，將USF1轉錄因子表達載體與pGL4.70-P7啟動子載體、pMIR reporter內參質粒等比共轉染到293T細胞中，轉染等量的pcDNA3.1空載體作為轉錄因子的對照組，培養(yǎng)24 h后進行雙熒光素酶活性檢測。結果顯示USF1顯著上調pGL4.70-P7活性（P < 0.000 1）。提示USF1對于miR-4811轉錄具有激活因子功能。

● USF1表達載體與核心啟動子重組質粒共轉染后檢測雙熒光素酶活性

進一步將USF1和其結合位點突變型重組載體P7-U1，P7-U2共轉染，對照野生型重組載體pGL4.70-P7，突變型載體雙熒光素酶活性均顯著下調（P < 0.000 1），佐證了上述2個位點是轉錄因子USF1直接結合位點。

● USF1調節(jié)野生型和突變型miR-4811基因啟動子效果比較分析

對于miRNA，目前研究更側重于miRNA下游靶基因網絡的構建、機制和功能研究，對miRNA基因轉錄調控機制的研究還很少，miRNA基因的正確轉錄表達受到一個復雜調節(jié)系統(tǒng)的調控，轉錄因子與啟動子中調節(jié)啟動子區(qū)域的互動是整個調控體系中至關重要的一環(huán)。本研究運用核心啟動子和轉錄因子結合位點生物信息學預測分析、基因克隆、點突變、雙熒光素酶報告基因法等技術，證實馬鹿miR-4811基因的核心啟動子位于上游-3 174 ~ -2 966 bp；轉錄因子USF1在-3 378  ~ 73 bp區(qū)域共有2個DNA結合位點，與miR-4811核心啟動子重疊；USF1作為激活因子可直接結合上述位點激活miR-4811核心啟動子上調雙熒光素酶報告基因轉錄表達。上述結論為進一步揭示馬鹿miR-4811轉錄調控機制和后續(xù)深入探究miR-4811調控鹿茸再生發(fā)育提供了重要基礎數據。

● 基金項目：國家自然科學基金項目（31671283）

● 第一作者簡介：高仰（2000—），男，碩士研究生；主要從事野生動物遺傳學研究。E-mail：614190397@qq.com

● *通信作者：鄭冬，E-mail：zhengdong89@163.com